做关于藻类的实验，以及如何测定水中的藻类含量。优选地包括测试设备。

实验14叶绿素A和B的测定(分光光度法)

一.目的

学习Chla和硼含量的测定方法，了解叶片中Chla和硼的含量。

二、材料、器具、仪器和药品

菠菜叶，721分光光度计，天平，研钵，剪刀，容量瓶(25ml)，漏斗，滤纸，乙醇(95%)。

第三，原则

叶绿素a和叶绿素b的最大吸收峰位于665nm和649nm处，在该波长处叶绿素a和叶绿素b的比吸收系数k已知，因此我们可以根据朗伯比尔定律列出浓度c与光密度d的关系:

d665 = 83.31Ca+18.60 CB……(1)

D649 = 24.54Ca卡+44.24卡。(2)

(1)在式(2)中，D665和D649是叶绿素溶液在665nm和649nm波长处的光密度。

是叶绿素a和叶绿素b的浓度，单位为克/升。

叶绿素a和叶绿素b在665nm波长处的比吸收系数分别为82.04和9.27。

16.75和45.6是叶绿素a和叶绿素b在649nm波长处的比吸收系数。

求解方程(1)(2)得到:

CA = 13.7 D665—5.76 D649………………………………(3)

CB = 25.8 D649—7.6 D665………………………………(4)

g = CA+CB = 6.10 D665+20.04 D649…………(5)

此时G为总叶绿素浓度，CA和CB为叶绿素a和叶绿素b的浓度，单位为毫克每升。通过使用上述公式(3)、(4)和(5)，可以计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的总含量。

四、方法步骤

1.称取0.1g鲜叶，切成片，置于研钵中，加入10ml乙醇，研磨成匀浆，加入5ml乙醇，过滤，最后用乙醇将滤液调至25ml。

2.取一个光学直径为65438±0cm的比色皿，注入上述叶绿素乙醇溶液，在另一个相同规格的比色皿中加入乙醇。作为对照，在721分光光度计下，分别在665nm和649nm波长处测量颜料溶液的光密度。

计算结果:

叶绿素a含量(毫克/克.湿重)=

叶绿素b含量(毫克/克湿重)=

总叶绿素(毫克/克湿重)=见链接。

u.edu.cn/jpkc/zwslx/fenye/jakj/li/shi-yan/14.htm

也

实验33叶绿素A和叶绿素B含量的测定(分光光度法)

原则

如果混合溶液中两种组分的光谱吸收峰明显不同，但吸收曲线相互重叠，在这种情况下，要分别测定两种组分，可以根据朗伯—比尔定律，用代数方法计算一种组分对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

如图9叶绿素a和叶绿素b的吸收光谱曲线所示，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲线相互重叠。

根据朗伯—比尔定律，具有不同最大吸收光谱峰的两种组分的混合溶液的浓度c与吸光度a之间存在以下关系(参见实验86):

a 1 = Ca ka 1+Cb kb 1(1)

A2=Ca ka2+Cb kb2 (2)

式中:Ca为组分A的浓度，g/L

Cb是组分b的浓度，g/l。

A1为混合溶液在波长λ1处的吸光度A值(即组分A的最大吸收峰波长)。

A2为混合溶液在波长λ2处的吸光度a值(即组分B的最大吸收峰波长)。

Ka1为组分A的比吸收系数，即当组分A的浓度为1g/L时，在波长处。

λ1处的吸光度值。

Kb2为组分B的比吸收系数，即浓度为1g/L时，组分B在波长λ2处的吸光度A值..

Ka2为组分A(浓度为1g/L)在波长λ2处的吸光度值。

Kb1为组分B(浓度为1g/L)在波长λ1处的吸光度A值。

叶绿素a和叶绿素b的80%丙酮溶液可以从文献中找到。当浓度为1g/L时，比吸收系数k为:

将表中的值代入上述公式(1)和(2)，我们得到:

A663=82.04×Ca+9.27×Cb

A645=16.75×Ca+45.60×Cb

整理后，得到如下公式:

ca = 0.012 7 A663—0.002 69 A645

Cb=0.022 9 A645—0.004 68 A663

如果将Ca和Cb的浓度单位由原来的g/L改为mg/L，上述公式可以改写如下:

Ca=12.7A663—2.69A645 (3)

Cb=22.9A645—4.68A663 (4)

CT = Ca+Cb = 8.02 a663+20.21a 645(5)

(5)其中Ct是总叶绿素浓度，单位为毫克/升..

使用上述公式(3)、(4)和(5)，可以计算叶绿素a和叶绿素b以及总叶绿素的浓度。

注:一般大学教学实验室使用的分光光度计多为721型，属于低级类型。单色光的半波宽度远大于中间型751型，而叶绿素a和叶绿素b的吸收峰之间的波长差仅为18 nm (663-645 nm)，很难实现精确测定。此外，有时测量的准确性甚至更差，因为仪器本身的标称波长与实际波长不匹配。根据公式，叶绿素a∶b值往往小于1，这并不奇怪。除了向学生解释原因，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。可以用纯叶绿素a和叶绿素b进行校准，分别在650-670 nm和630-650nm的波长下，以65438±0-2nm的间隔测量叶绿素a或叶绿素b的吸光度a，以确定叶绿素a和叶绿素b的吸收峰的波长。 可以按照仪器说明书中的步骤进行校正，或者更方便的方法是打开仪器盖，松开波长刻度盘的紧固螺钉，调整刻度盘使波长达到正确值，然后拧紧螺钉即可恢复仪器。

校正仪器波长所需的叶绿素a和叶绿素b的量很少，用纸层析可以快速分离。取植物叶片约1g，用乙醚提取叶绿体色素，然后用毛细管将色素溶液画在3mm厚的滤纸上，使之成一条直线。为了使分离效果好，一般重复采样一次。然后在密闭容器中进行向上层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。色谱结束时，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，剪的时候注意避开可能被污染的颜色区域。最后，将它们浸泡在80%的丙酮中，将叶绿素a和叶绿素b洗掉。

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只是测量叶绿素a是常规的表示藻类总量的方法，网上也有一些直接测量藻类的仪器。你可以搜索它们。